神經生長因子的發現與鑑定

在這時候，一位出生於紐約市的年輕生化學家加入了李威－蒙塔西尼的研究行列，他就是今年諾貝爾獎的另一位得主柯恩教授。柯恩一開始希望純化神經生長因子，並鑑定它的組成究竟是什麼。於是他就先利用各種不同的?去處理神經生長因子。如果神經生長因子是蛋白質，那麼它的活性就會被蛋白質水解?所破壞。出乎每一個人意料之外，當柯恩將神經生長因子用由蛇毒粗製的雙磷酯?（phosphodiesterase）處理後，活性不僅沒有降低，反而增加了很多；進一步的探討，發現蛇毒裡有非常高的神經生長因子活性。

這個意外的發現使柯恩推想蛇毒相當於蛇的唾液，那麼一般動物的唾液腺是否也會製造神經生長因子呢？結果不出所料，老鼠體內神經成長因子最豐富的組織就是分泌唾液的唾液腺（salivary gland）。利用唾液腺作材料，神經生長因子終於被完全純化，它平常以7S（S表示沈降係數）和2.5S二種形態存在。2.5S的神經生長因子由二個相同的單元體組成。單元體含118個胺基酸，這是具有活性的神經生長因子。7S的神經生長因子則由三種不同的單元體── α 、 β 和 γ 各二個所組成。 β 單元的胺基酸順序和2.5S的單元體完全相同，只是N端多了8個胺基酸而C端多了一個精胺酸（arginine）而已，但它沒有活性。7S神經生長因字是2.5S神經生長因子穩定的儲存前身。

神經生長因子有非常廣泛的生物活性。利用它的抗體注射到新生老鼠身上，抗體會中和小老鼠體內的神經生長因子，並且老鼠體內正在發育中的周邊交感神經及感覺神經就都會死亡。在體外培養的實驗中也可以證明，神經生長因子是交感神經、感覺神經和嗜鉻性細胞（chromaffin cell）生長、分化所必需的。

1961年，李威－蒙塔西尼終於回到義大利繼續她的研究工作。另一方面，柯恩教授在李威－蒙塔西尼實驗室，研究神經生長因子過程中注意到一些不太尋常的事，那就是當神經生長因子（老鼠唾液腺的萃取物）注射到新生老鼠後，除了神經細胞的生長受到影響外，老鼠睜眼的時間也比對照組提升了許多（6天相對於14天），因此他認為在老鼠唾液腺中除了神經生長因子外，一定還有其他的生長因子。1960年，柯恩教授也離開華盛頓大學到田納西州的Vanderbilt大學生化系任教，繼續追問那些生長因子是什麼。他利用新生老鼠提早睜眼作為一個生物活性的測定方法，1962年終於從老鼠唾液腺中分離出另一個生長因子命名為「上皮細胞生長因子」（epidermal growth factor，簡稱EGF）。1972年柯恩的實驗室決定了上皮細胞生長因子的一級結構，證明這生長因子由53個胺基酸組成。

以後柯恩繼續探討上皮細胞生長因子的作用機制，他從人尿中分離出人的上皮細胞生長因子，雖然與老鼠上皮細胞生長因子的胺基酸順序不完全相同，但也能刺激上皮細胞或纖維細胞的生長。有趣的是，這個人類上皮細胞生長因子的胺基酸順序後來發現，與別人從尿裡分離出會抑制胃酸分泌的urogastrone的胺基酸順序完全相同。到現在還沒有人了解上皮細胞生長因子刺激細胞生長與抑制胃酸分泌之間有什麼關係。

到了七○年代後期，致癌基因的發現，使上皮細胞生長因子的研究和癌細胞的生長控制之間產生了密切的關連。上皮細胞生長因子對細胞的作用必先與細胞表面的上皮細胞生長因子受體結合，而柯恩首先發現在一個人類上皮癌細胞A431上，上皮細胞生長因子受體本身有酪胺酸激?（tyrosine protein kinase）的活性，而這個激?活性受上皮細胞生長因子的控制。由於酪胺酸激?也是許多致癌基因特有的生化活性，所以二者對細胞生長控制之間必有若干相通之處。後來發現有一個致癌基因──erb B，和上皮細胞生長因子受體在細胞質內攜有激?活性的那一段蛋白類似，更加重了二者間的關連。

柯恩教授在八○年代仍然延續他對上皮細胞生長因子的研究，致力於了解上皮細胞生長因子的作用機制。他認為如果上皮細胞生長因子能活化其受體激?的活性，的確就是上皮細胞生長因子作用的第一步，那麼當急之務就是要鑑定上皮細胞生長因子受體激?被活化以後，在細胞裡究竟磷酸化了那一些受質，透過對那些受質與上皮細胞生長因子受體之間作用的了解，我們當可進一步認識細胞的生長控制。經過許多繁複的過程，柯恩在兩年前終於純化了一個分子量為35,000道耳吞的蛋白，這個蛋白在細胞內能被上皮細胞生長因子受體磷酸化，磷酸化的程度則受上皮細胞生長因子控制。